Diagnosticul botulismului se bazează pe identificarea toxinei botulinice Clostridium în laborator și pe observarea simptomelor clinice, chiar dacă uneori acestea sunt nespecifice. De fapt, boala poate fi confundată cu sindromul Guillain-Barré, poliomielita, accident vascular cerebral, miastenia gravis și paralizia căpușei.
În botulismul alimentar, imaginea tulburărilor neuromusculare și ingerarea alimentelor potențial contaminate sunt indicii importante. Manifestarea simultană la cel puțin 2 pacienți care au mâncat aceeași hrană simplifică diagnosticul. Confirmarea este obținută prin izolarea microorganismului cu cultura de probe de alimente sau fecale suspectate ale pacientului și cu identificarea toxinei botulinice în alimente sau materiale biologice (cum ar fi sânge, suc gastric și vărsături).
În botulismul rănilor, pe de altă parte, căutarea pentru toxina serică sau izolarea Clostridium botulinum dintr-o probă din leziunea pielii confirmă diagnosticul.
